SuperRT一步法RT-PCR試劑盒說明書

SuperRT One Step RT-PCR Kit

目錄號(hào)：K0742

保存條件：-20℃保存。

組分說明

           Cat. No.                       K0742

           Kit Size                        100

           SuperRT OneStep RT-PCR EnzymeMix       50 μl

           2×OneStep RT-PCR Buffer             1.4 ml

           RNase-Free Water                   1 ml

             本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及其他用途  

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

　　本試劑盒是專為一步法RT-PCR實(shí)驗(yàn)研制，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行，

反應(yīng)過程中無需添加試劑，無需打開管蓋，在避免污染的同時(shí)提高了檢測(cè)靈敏度和實(shí)驗(yàn)

效率。本試劑盒包括全新高效逆轉(zhuǎn)錄酶、快速熱啟動(dòng)DNA聚合酶，同時(shí)包含適用于逆轉(zhuǎn)

錄和PCR擴(kuò)增的反應(yīng)緩沖液和實(shí)驗(yàn)中所必需的其它組分。SuperRT逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H活

性缺失，減少了逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中 RNA的降解。該逆轉(zhuǎn)酶逆轉(zhuǎn)錄效率高，可對(duì)少量 RNA模

板進(jìn)行良好的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。 PCR反應(yīng)使用的快速熱啟動(dòng) DNA聚合酶具有擴(kuò)增效率高、

特異性強(qiáng)、延伸速度快的優(yōu)良性能。*的緩沖體系使逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶同時(shí)發(fā)揮大

功效。使用本試劑盒擴(kuò)增得到的目的產(chǎn)物3′端附有一個(gè)″A″堿基，可直接用于T/A克隆。

注意事項(xiàng)

1．在操作過程中應(yīng)避免RNase污染，防止RNA降解或?qū)嶒?yàn)中的交叉污染，建議在專門

   的區(qū)域進(jìn)行RNA操作，使用專門的儀器和耗材，操作人員帶口罩和一次性手套并經(jīng)

   常更換手套。

2．實(shí)驗(yàn)盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，應(yīng)使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙

   酯）水溶液在37℃處理12小時(shí)，并在120℃下高壓滅菌30分鐘后使用，或者將玻璃

   器皿在180℃下干熱滅菌60分鐘后使用。實(shí)驗(yàn)中用到的無菌水應(yīng)使用 0.1%的DEPC

   處理后進(jìn)行高壓滅菌。

3．本試劑盒中的所有試劑使用前請(qǐng)上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經(jīng)短暫離心

   后使用。所涉及的酶類使用后應(yīng)盡快放回-20℃，避免反復(fù)凍融。

4．本試劑盒必須使用特異性引物，引物的選擇可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來選擇，引物設(shè)計(jì)的好

   壞直接影響到RT-PCR  反應(yīng)的結(jié)果，設(shè)計(jì)引物時(shí)需考慮GC含量，引物長(zhǎng)度，引物

   位置，PCR產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)等因素，建議采用專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件來設(shè)計(jì)。

使用方法

1．將RNA模板、引物、  OneStep  RT-PCR   Buffer、SuperRT    OneStep   RT-PCR

   EnzymeMix和RNase-Free   Water溶解并置于冰上備用。

2．根據(jù)以下表格配制反應(yīng)體系：

試劑                             25 μl反應(yīng)體系    終濃度

      2×One Step RT-PCR Buffer          12.5 μl     1×

      Forward Primer，10 µM            1 μl       0.4 μM

      Reverse Primer，10 µM            1 μl       0.4 μM

      SuperRT OneStep RT-PCR EnzymeMix     0.5 μl

      RNA Template X μl              1 pg – 1 µg

      RNase-Free water               up to 25 μl

   注意：引物濃度請(qǐng)以終濃度0.1-1.0 μM作為設(shè)定范圍的參考。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。

3．渦旋震蕩混勻，短暫離心，將溶液收集到管底。

4．將熱循環(huán)儀預(yù)熱到45℃，將PCR管置于熱循環(huán)儀中，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。

   反應(yīng)條件：

  步驟            溫度        時(shí)間

 反轉(zhuǎn)錄           45℃         30 min

 PCR預(yù)變性         95℃       2 min

 變性          94℃         30 s

 退火             55-65℃      30 s      30-40個(gè)循環(huán)

 延伸           72℃       30 s

 終延伸          72℃       5 min

   注意：1）一般PCR實(shí)驗(yàn)中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度Tm低5℃，退火時(shí)間一般為20-30秒，無法得到理想的擴(kuò)增效率時(shí)，適當(dāng)降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應(yīng)條件。

   2）延伸時(shí)間根據(jù)擴(kuò)增的片段大小設(shè)定，本產(chǎn)品中包含的DNA Polymerase擴(kuò)增效率為1 kb/30s。

   3）可根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的下游應(yīng)用設(shè)定循環(huán)數(shù)。循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足；循環(huán)次數(shù)多，錯(cuò)配機(jī)率會(huì)增加，非特異性背景嚴(yán)重。所以，在保證產(chǎn)物得率的前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。

5．反應(yīng)結(jié)束后取5 µl反應(yīng)產(chǎn)物，加入適量上樣緩沖液后進(jìn)行電泳檢測(cè)結(jié)果。

     相關(guān)產(chǎn)品信息

目錄號(hào)      產(chǎn)品名稱            產(chǎn)品特點(diǎn)

K0580      TRIzon總RNA提取試劑      適用范圍廣的RNA提取試劑

K0581      超純RNA提取試劑盒                  兼具有適用范圍廣和純度高特點(diǎn)的RNA提取試劑

K0597    超純RNA提取試劑盒（含DnaseI）靈敏度高，可識(shí)別pg級(jí)別的模板。與RNA 親和力強(qiáng)，

K0741      SuperRT cDNA第--鏈合成試劑盒        能夠通讀GC含量高，二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的RNA模板。

K0744   HiFi-MMLV cDNA第--鏈合成試劑盒高效獲得cDNA產(chǎn)物

SuperQuickRT  cDNA第--鏈合成試逆轉(zhuǎn)錄（針對(duì)于熒光定量PCR）

K2381 劑盒(For Real-time PCR)      僅需15分鐘，即可完成熒光定量PCR所需的cDNA

SuperQuickRT MasterMix     即用型逆轉(zhuǎn)錄mix，只需加入RNA和水即可反應(yīng)。僅

K2391   (for Real-Time PCR) 需15分鐘，即可完成熒光定量PCR所需的cDNA

K0688   Es Taq DNA Polymerase   兼具高擴(kuò)增效率和高保真性的PCR產(chǎn)品

K0690   Es Taq MasterMix

K0957   UltraSYBR Mixture       熒光定量PCR—SYBR Green法

K0956   UltraSYBR Mixture（With ROX）  特異性強(qiáng)、Ct值低、定量更準(zhǔn)確

實(shí)驗(yàn)室代做實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目