2.反應溫度及片段要求

 

室溫下（20-30℃）放置 0-5 分鐘，然后將離心管放置在冰上。如當天不進行轉化實驗。請將連接產物置于-20℃保存。

 

注意：DNA *#片段的用量見下表

 

 

 

室溫下（20-30℃）反應時間 5-30 分鐘，如果室溫較低，推薦使用 PCR 儀器控制溫度?？梢栽O置 25℃反應 5 分鐘。如果 PCR 產物電泳檢測僅有很銳利明亮的條帶，無引物二聚體和非特異性條帶存在，可直接取 0.5-1µl PCR 產物原液進行克隆。

 

3.陽性對照反應

 

取1µl 試劑盒提供的1kb長度的對照片段LacZ 基因α肽片段進行克隆，轉化具有α 互補功能的大腸桿菌感受態細胞（如 DH5α,*0,Mach1-T1 等）。菌液涂布在含有IPTG,X-gal 的LB 氨芐平板上，次日藍色菌落為陽性克隆，說明有片段插入，白色菌落為空載體。

 

4.轉化

 

1.取5µl 連接產物到50-100µl 剛剛融化的感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴2-30 分鐘。

 

2.42℃水浴中熱擊30 秒鐘。

 

3.立刻置于冰水浴中2 分鐘。

 

加入300-500µl 無菌的不含抗生素的SOC 或LB，37℃，200-250rpm 振蕩培養60 分鐘。

 

注：小于 2kb 片段可以不復蘇，直接涂平板。

 

4.吸取200µl 菌液涂布。為了得到更多的菌落，可以先4000rpm 離心1 分鐘，去掉部分上清，用移液器輕吹菌體，充分懸浮菌液，取全部菌液涂布，然后 37℃培養過夜（12-16 小時）。

 

5.陽性重組子的鑒定菌落 PCR

 

（1）菌落PCR方法鑒定陽性克隆

 

① 用10l吸頭挑選克隆至預先加有10μl無菌水或LB培養基的PCR管中，吹打混合。

 

② 25l PCR反應體系：取2μl細菌懸液為模板、加入5μM 濃度的M13F/M13R各

 

1μl進行PCR擴增。

 

③PCR擴增條件：95℃預變性5分鐘（裂解細胞，失活核酸酶），94℃變性10秒鐘，55℃退火10秒鐘，72℃延伸（ 根據片段的大小決定延伸時間，通常每1min/1kb）X秒，30個循環，72℃后延伸5分鐘。1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果，有強烈的明顯條帶的克隆為重組體，與插入片段大小相近（M13F/M13R 引物在克隆位置的兩側，所以PCR擴增出的DNA的長度比插入片段大138bp） 可視為陽性克隆。菌落PCR方法鑒定重組子時一定要設立一個不加菌液的陰性對照。

 

（2）測序：用M13F、M13R通用引物對陽性質粒進行測序分析。

 

pBM16A載體圖譜

 

常見問題分析

 

重組子克隆菌少，或陽性率低：

 

(1)感受態效率低，使用轉化效率>5×107cfu/µg 的感受態細胞

 

(2)連接反應在低溫下（如放碎冰上）操作，應該在室溫下操作。

 

(3)PCR 片段加入量太多或太少，按照推薦量加入。

 

(4)PCR 純度低，重新擴增或重新純化PCR 產物。

 

(5)PCR 質量低，切膠時在紫外下照射時間長，需重新制備。

 

(6)PCR 擴增結束后，應該再延伸 5-10 分鐘，確保片段延伸*。

 

(7)轉化后沒有復蘇培養，可以加入 SOC 或LB，培養 60 分鐘。

 

(8)克隆基因可能對宿主菌有毒性，比如某些編碼膜蛋白和 DNA 結合蛋白的基因， 某些啟動子和調節序列基因，或含有倒置或串聯重復序列的基因，選用室溫過夜培養平板。

 

載體序列：

 

>pBM16A Topo AGTGAGTTGATTGTGTAAAACGACGGCCAGTGTCTGAGGCTCGCTTCAGTCCTGATGCTTGATATCCCGGGCGT GTCGCCCTT$$$$AAGGGCGACACGCCCGGGATATCGCGTCTGCCTGAAGTCAATACTGACGATGGTCATAGCT GTTTCCTGTCCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCC AACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGA AGCTAAAATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCACTTATTCCGTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTG CTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTG GATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGT TCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTC AGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGC AGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCT AACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCA TACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAA CTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCG CTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGCTCTCGCGGTATCATTG CAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGAT GAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAATGAGGGCCCAAATGTAATCA CCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATC ACAAAAATCGATGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGA AGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAG CGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTG TGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGA CACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGA GTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAG TTACCTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTT GCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATTTTCTACCGAAGAAAGGCCCAC CCGTGAAGGTGAGCC

 

本產品僅供研究不用于臨床診斷