血液RNA提取試劑盒（）說明書

RNApure Blood Kit（DNase I）

血液RNA提取試劑盒（DNase I）

Cat. No.   K0538

保存：DNase I、10×Reaction Buffer：-20℃

其它組分：室  溫

組分說明

          Cat. No.                          K0538

          Kit Size                           50

          DNase I                          1000 U

          10×Reaction Buffer        1000  μl

          Buffer RBL（10×）       60 ml

          Buffer RL                             35 ml

          Buffer RW1                            40 ml

          Buffer RW2（concentrate）   11 ml

          RNase-Free Water                     10 ml

          Shredder Spin Column                50

          Spin Column RM                   50

          Collection Tube（1.5 ml）     50

          Collection Tube（2 ml）      100

產品簡介

    本試劑盒適用于從新鮮全血（用檸檬酸鹽、EDTA 或肝素等抗凝劑處理過的血液樣品）中提取總  RNA，可以處理多至1.5  ml 的全血，洗脫得到分子量大于 200 bp 的高純度 RNA，多個樣品可以在 1 小時內同時完成。本產品無需 CsCl 純化的超離心步驟和 LiCl 或乙醇沉淀，不含有苯酚或氯仿等有毒溶劑，經過純化的 RNA 有效去除血紅素、肝素等酶抑制劑和污染物，可直接用于各種分子生物學常規實驗，如 RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、體外翻譯等實驗。

注意事項

1.  預防 RNase 污染，應注意以下幾方面：

    1）使用無 RNase 的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。

    2）玻璃器皿應在使用前于 180℃高溫下干烤 4 小時，塑料器皿可在 0.5M NaOH 中浸泡 10 分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。

    3）配制溶液應使用無 RNase 的水。

    4）操作人員戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套。

2.  樣品應避免反復凍融，否則影響提取 RNA 提取得率和質量。樣品在 Buffer RL 中，可于-70℃保存一個月。

3.  Buffer RL 在使用前請加入β-巰基乙醇，1 ml Buffer RL 加 10  μl  β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的 Buffer RL 室溫可保存 1 個月。

4.  第一次使用前應按照試劑瓶標簽的說明先在 Buffer RW2 中加入無水乙醇。

5.  使用前請檢查 Buffer RL 是否出現結晶或者沉淀，可置于于 56℃水浴重新溶解。

6.  本試劑盒不能用于加入抗凝劑的冷凍血液樣本 RNA  的提取。  

7.  10×Buffer RBL 需在使用前將溶液用無 RNase 的水進行 10 倍稀釋，稀釋后置于 2-8℃保存。

自備試劑： β-巰基乙醇、無水乙醇

操作步驟

1.  向0.5-1.5 ml  新鮮的抗凝全血樣本中，加入5倍體積的1x Buffer RBL（請于使用前用無RNase水將10×Buffer RBL稀釋10倍），輕輕渦旋或顛倒混勻。冰上孵育10-15分鐘，孵育過程中混勻兩次。

    注意：孵育過程中渾濁的懸液會變成透明，證明紅細胞被裂解，必要時可以把孵育時間延長至20分鐘。

2.  4℃  2,100 rpm（~400×g）離心10分鐘，小心吸棄上清。

3.  向以上沉淀中加入2倍血液樣本體積的1×Buffer  RBL（請于使用前用無RNase水將10×Buffer RBL稀釋10倍），輕輕渦旋，充分重懸沉淀。

4.  4℃  2,100 rpm離心10分鐘，小心并*吸棄上清。

    注意：此步一定要*去除上清否則影響裂解導致RNA產量下降。

5.  向沉淀中加入Buffer RL（使用前檢查是否已經加入β-巰基乙醇），0.5-1.5 ml血液樣本加入600  μl Buffer RL，或小于0.5 ml  血液樣本加入350 μl Buffer RL，混勻。

6.將所得液體轉移到已裝入收集管（Collection Tube）的過濾柱（Shredder Spin Column）中，12,000 rpm（~13,400×g）離心2分鐘，收集濾液，棄掉過濾柱。

7. 向所得濾液中加入1倍體積（600  μl或350 μl）的70%乙醇（無RNase水配制），混勻。

    注意：加入乙醇后可能會產生沉淀，不會影響后續實驗。

8.將上步所得溶液全部加入到已裝入吸附柱（Spin Column RM）中（已裝入收集管），若一次不能加完溶液，可分多次轉入。12,000 rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

9.  向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1，10,000 rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

10.  配制DNase I  混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8  μl 10×Reaction Buffer 和20  μl DNase I（1U/μl），混勻，  配制成終體積為80 μl的反應液。

11.  向吸附柱中直接加入80 ?l DNase I  混合液，20-30℃孵育15分鐘。

12.  向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1，10,000 rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

13.  向吸附柱中加入500  μl Buffer RW2（使用前檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

14.  重復步驟13。

15.  12,000 rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數分鐘，以*晾干。

    注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續的酶促反應（酶切、PCR  等）。

16.  將吸附柱置于一個新的RNase-Free的1.5  ml  離心管（自備）中，向吸附柱的中間部位加入  30-50 μl  RNase-Free Water，室溫放置1分鐘，12,000 rpm離心1分鐘，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。

注意：1）RNase-Free Wate體積不應小于30  μl，體積過小影響回收率。

2）如果要提高RNA的產量，可用30-50  μl新的RNase-Free Water重復步驟16。

3）如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復步驟16。

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