甲基化DNA檢測試劑盒說明書

DNA Methylation Kit

目錄號：K2140

保存：室溫

組分說明

Cat. No.                                            K2140                  K2140A

Kit Size                                                 10                    50

CT Conversion Reagent               10 reations              50 reations

M-Dissolving Buffer             10 reations（100 μl）  50 reations（粉末）

M-Dilution Buffer                         400 μl               2 ml

M-Buffer PA                               15 ml                60 ml

M-Wash Buffer（concentrate）        2 ml             15 ml

M-Elution Buffer                                 1 ml                 10 ml

Buffer PS                                    5 ml                 15 ml

Spin Column DS                             10                    50

Collection Tube（2ml）               10                50

產品簡介

    本試劑盒采用高溫處理方法，縮短了轉變時間，提高了轉變效率，轉變效率可達到 99%以上。經過 DNA亞硫酸氫鹽轉變，可回收得到大量 DNA。本試劑盒基本原理為 DNA 經亞硫酸氫鈉處理后，可使未甲基化的胞嘧啶轉變為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。

    本試劑盒采用硅基質膜式純化柱通過簡單的結合-洗滌-洗脫步驟，可從甲基化修飾后的溶液中回收純化 DNA，回收的DNA 純度高，完整性好，可直接用于測序、甲基化 PCR 檢測、芯片分析、連接和轉化、酶切、標記、顯微注射、PCR 和體外轉錄等各種分子生物學實驗。

注意事項

1.   產品配用方法：

（1）10次包裝配制方法：CT Conversion Reagent是固體混合物，一定要在首次使用前制備好。將2 ml  無菌水、100μl M-Dissolving Buffer和300  μl M-Dilution Buffer加入到CT Conversion Reagent管中。 在55°C溶解并震蕩直至全部溶解。在使用之前將 CT Conversion Reagent 溶液在室溫(20°C -30°C)下避光保存。每管的CT Conversion Reagent是針對10次DNA 處理設計的，為了得到較好的結果, CT Conversion Reagent應當在制備后立即使用，如果不立即使用，可將CT Conversion Reagent  溶液在-20°C存儲1周，使用前，請務必將存儲的CT Conversion Reagent 溶液在室溫下解凍，并且通過振動或顛倒2分鐘以充分混勻，CT Conversion Reagent對光很敏感，所以要盡量減少在光下的暴露。

（2）50 次包裝配制方法：CT Conversion Reagent、M-Dissolving Buffer 均固體混合物，一定要在首次使用前制備好。將 5ml 無菌水加入到 M-Dissolving Buffer 中震蕩溶解，待固體全部溶解后將 M-Dissolving Buffer 管中溶液全部轉移至CT Conversion  Reagent 管中同時補加 5.5ml 無菌水。再將 1.5ml M-Dilution Buffer 加入到 CT Conversion  Reagent

管中。在 55°C 溶解并震蕩直至全部溶解。在使用之前將 CT Conversion Reagent  溶液在室溫 (20°C -30°C)下避光保存。每管的  CT Conversion Reagent 是針對 50 次 DNA  處理設計的，為了得到較好的結果, CT Conversion Reagent 應當在制備后立即使用，如果不立即使用，可將  CT Conversion Reagent 溶液在-20°C 存儲 1 周，使用前，請務必將存儲的 CT Conversion Reagent 溶液在室溫下解凍，并且通過振動或顛倒 2 分鐘以充分混勻，CT Conversion Reagent 對光很敏感，所以要盡量減少在光下的暴露。

2.  第一次使用前應安裝試劑瓶標簽的說明先在M-Wash Buffer中加入無水乙醇。

自備試劑：無水乙醇、75%乙醇

操作步驟

每次制備的 DNA 范圍在  1 ng-4  μg 之間，最佳量為 500 ng-2μg。

1. 取 20 μl DNA 樣品，加入到離心管（自備）中，如果樣品量不足，用水補至 20μl。

2. 向 DNA 樣品中加入 2.2 μl  的 M-Dilution Buffer，混勻樣品。

3. 42℃水浴 30 分鐘。

4. 向上步得到的樣品中，加入 220 μl 配制好的  CT  Conversion  Reagent 溶液，混勻，80℃恒溫水浴鍋中避光孵育 60分鐘。

5. 向上步溶液中加入 480 μl M- Buffer PA，溫和上下顛倒混勻。

6. 柱平衡：向已裝入收集管（Collection Tube）的吸附柱（Spin Column CS）中加入 200  μl Buffer PS，12,000 rpm（~13,400×g）離心 2 分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

7. 將步驟 5 所得溶液全部加入到吸附柱（已裝入收集管）中，室溫放置 2 分鐘，12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

   注意：吸附柱最大容量為700  μl，若樣品體積大于700 μl可分批加入  。

8. 向吸附柱中加入 500 μl M- Buffer PA，12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉收集管中的廢液，  將吸附柱放回收集管中。

9. 向吸附柱中加入 650 μl  M-Wash Buffer（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

10. 12,000 rpm 離心 2 分鐘，倒掉廢液，將吸附柱置于室溫數分鐘，以*晾干。

   注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余乙醇去除，乙醇殘留會影響后續的酶促反應（酶切、PCR等）

11. 將吸附柱放入一個新的離心管（自備）中，向吸附膜中間位置懸空滴加 20 μl M-Elution Buffer（pH  8.5），室溫放置 2 分鐘。12,000 rpm 離心 1 分鐘收集 DNA 溶液。

12. 向收集的 20 μl DNA 中加入 2.2  μl M-Dilution Buffer，室溫靜止 30 分鐘。

13. 向溶液中加入 500 μl 預冷的無水乙醇顛倒混勻，沉淀 30 分鐘（建議置于-20℃沉淀，過夜沉淀效果更好）。

14. 12,000 rpm 離心 15 分鐘，輕輕倒掉上清，再用 75%乙醇洗滌一次。

15. 12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉上清，室溫下待乙醇揮發后，加入 20 μl M-Elution Buffer 溶解，DNA 置于-20℃保存。此步收集的 DNA 可以用于后續相關實驗。

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