FastTaqMan Mixture（With ROX）說明書

Cat. No.   K2390

保存：-20℃避光

如需頻繁使用，2-8℃保存，盡量避免反復(fù)凍融。

組分說明

                          2×FastTaqMan Mixture

 Cat. No.     Kit Size                                          RNase-Free Water（With ROX）

K2390     50 μl 反應(yīng)×40 次（1 ml）  1 ml                      1 ml

K2390A   50 μl 反應(yīng)×200 次（5 ml） 5×1 ml                 5 ml

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

    FastTaqMan Mixture(With ROX)是專用于探針法(TaqMan，Molecular Beacon 等）實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的預(yù)混體系，濃度為 2×,包含 Fast Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、Mg 2+ 和 ROX 校正染料，操作簡(jiǎn)單方便。主要用于基因組 DNA 靶序列和 RNA 反轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 靶序列檢測(cè)。本品含有的 Fast Taq DNA Polymerase，能有效減少在常溫條件下由引物和模板非特異性結(jié)合或引物二聚體而產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增，酶的激活僅需在 95℃孵育 30s。整個(gè) PCR 反應(yīng)過程比普通反應(yīng)可節(jié)省約 40 分鐘，大大縮短了 PCR 的反應(yīng)時(shí)間。*的 PCR 緩沖體系與快速熱啟動(dòng)酶的組合，有效抑制了非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，并顯著提高了 PCR 的擴(kuò)增效率，熒光信號(hào)更強(qiáng)，靈敏度更高，線性范圍更寬。該產(chǎn)品適用范圍廣，可用于普通和快速定量 PCR 程序。所含的 ROX 染料可校正定量 PCR 儀孔與孔之間產(chǎn)生的熒光信號(hào)誤差, 適用于以 ROX 作為校正染料的熒光定量 PCR 儀。

注意事項(xiàng)

1     使用前請(qǐng)上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經(jīng)短暫離心后使用。

2     本產(chǎn)品中含有熒光染料 ROX，保存本產(chǎn)品或配制 PCR 反應(yīng)液時(shí)應(yīng)避免強(qiáng)光照射。

3     避免反復(fù)凍融本品，反復(fù)凍融可能使產(chǎn)品性能下降。本產(chǎn)品長(zhǎng)期保存可置于-20℃，避光。如果在短期內(nèi)需要頻繁使 用，可在 2-8℃保存。  

使用方法

以下舉例為常規(guī)的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，實(shí)際操作中應(yīng)根據(jù)模板、引物結(jié)構(gòu)和目的片段大小的不同進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)和優(yōu)化。

1.   PCR反應(yīng)體系：

試劑                            50 μl反應(yīng)體系     終濃度

2×FastTaqMan Mixture（With ROX）    25 μl                    1×

Forward Primer，10 µM                      1μl                0.2 μM 1）

Reverse Primer，10 µM                       1μl                 0.2 μM   1）

Probe，10  μM                                 1μl                0.2  μM  2）

Template DNA                                    2 μl 3）

RNase-Free Water                             up to 50  μl

     注意：1）通常引物濃度以0.2  μM可以得到較好結(jié)果，可以在0.1-1.0 μM作為設(shè)定范圍的參考。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；

發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。

2）所用探針的終濃度，與使用的熒光定量PCR儀、探針種類、熒光標(biāo)記物質(zhì)種類有關(guān)，實(shí)際使用時(shí)請(qǐng)參照儀器說明書，或各熒光探針的具體使用要求進(jìn)行濃度的調(diào)節(jié)。

3）通常DNA模板的量以10-100 ng基因組DNA或1-10 ng cDNA為參照，因不同物種的模板中含有的目的基因拷貝數(shù)不同，可對(duì)模板進(jìn)行梯度稀釋，以確定最佳的模板使用量。

2.   PCR反應(yīng)程序：

     兩步法PCR：

步驟                     溫度               時(shí)間

預(yù)變性                    95℃              30 s  1）

變性                     95℃              5 s       

                                            35-40 個(gè)循環(huán)

退火/延伸       2）        60℃              30 s

     注意：1）本產(chǎn)品所采用的酶須在預(yù)變性95℃、30s條件下實(shí)現(xiàn)酶的活化。在此條件下，大多數(shù)模板可良好的進(jìn)行解鏈。對(duì)GC含量高、二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的模板，可將預(yù)變性時(shí)間延長(zhǎng)至1～4分鐘，以使起始模板充分解鏈。

2）建議采用兩步法PCR反應(yīng)程序，若因使用Tm值較低的引物等原因，得不到良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，可嘗試進(jìn)行三步法PCR擴(kuò)增，退火溫度請(qǐng)以  56℃-64℃的范圍作為設(shè)定參考。

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