EF20A\J2                      2016-01版

己烯雌酚

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物己烯雌酚將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗己烯雌酚抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物己烯雌酚的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物己烯雌酚的含量。

二、試劑盒特性

u 試劑盒靈敏度：   0.1ppb

u 孵育溫度：       37℃

u 孵育時間：       30min～30min～15min

u 樣本檢測下限

組織（蝦、魚） ·······························  0.2 ppb

豬肉/肝 雞肉/肝  ·······························  2 ppb

肌肉組織(方法二)  ···························  0.1 ppb

飼 料  ············································  20ppb

尿 液  ···········································  0.6ppb

u 交叉反應率

己烯雌酚  ········································  100%

雙烯雌酚  ········································  38.5%

己烷雌酚  ········································  8.5%

己炔雌二醇  ···································  ﹤0.1%

雌三醇  ·········································  ﹤0.1%

u 樣本回收率

飼  料 ··········································  90±10%

組  織 ··········································  85±10%

尿  液 ··········································  70±10%

三、試劑盒組成

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標儀、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、恒溫箱

微量移液器：單道 20～200µl、單道100～1000µl、多道 30～300 µl

試      劑：乙腈、氫氧化鈉、氯仿、丙酮、濃磷酸（含量85%）、乙酸乙酯

五、樣本前處理步驟

u 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

u 樣本前處理需配制：

配液1   6M H₃PO₄ 溶液

100ml 濃H₃PO₄（含量85%）加去離子水150ml混合均勻。

配液2   2M NaOH溶液

8gNaOH加去離子水100ml溶解。

配液3   1M NaOH溶液

4gNaOH加去離子水100ml溶解。

配液4   乙腈-丙酮混合液

V_乙腈-V_丙酮  =  4 : 1

配液5   樣本復溶液：

將5X濃縮復溶液用去離子水1：4稀釋。

u 樣本處理：

（a）組織（雞、鴨、豬肉/豬肝、蝦、魚)處理方法

1、 稱取2±0.05g勻漿后的樣本，加入6ml乙腈-丙酮混合液，震蕩2min，15℃，4000r/min以上，離心10min。

2、 取3ml上清液，60℃氮氣/空氣吹干。

3、 加入0.5ml氯仿，渦動20s，加入2ml 2M NaOH，渦動30s，4000r/min以上，離心5min。

4、 取1ml上清液，加入200µl 6M H₃PO₄，渦動5s。

5、 加入3ml乙腈萃取，振蕩2min，室溫4000r/min以上，離心10min，取上層有機相， 60℃氮氣/空氣吹干。

6、 用1ml樣本復溶液溶解干燥的殘留物，混勻30s。

不同樣本按如下方法稀釋：

1、 蝦魚：直接取50µl水相用于檢測。

2、 豬肉/肝、雞肉/肝：取50µl水相加入450µl樣本復溶液，渦動混合30s；取50µl用于檢測。

樣本的稀釋倍數：

蝦魚稀釋倍數：2       

豬肉/肝、雞肉/肝稀釋倍數：20

（b）肌肉組織處理方法二

1、 稱取2±0.05g勻漿后的樣本，加入2ml  2M NaOH溶液，震蕩2min；

2、 加入8ml乙酸乙酯，劇烈震蕩5min ； 

3、 15℃，4000r/min以上，離心10min；

4、 取4ml上層有機相， 60℃氮氣/空氣吹干；

5、 用1ml樣本復溶液溶解干燥的殘留物，混勻30s。

樣本稀釋倍數：1

（c）飼料處理方法

1、 稱取2±0.05g搗粹后的飼料樣本，加入8ml乙腈，振搖2min，15℃ 4000r/min以上離心10min；

2、 取2ml上清液，60℃氮氣/空氣吹干；

3、 加入0.5ml氯仿，渦動20s，加入2ml 1M NaOH，渦動30s，4000r/min以上，離心5min；

4、 取1ml上清液，加入100µl 6M H₃PO₄，渦動5s；

不同樣本按如下方法稀釋：

1、 配合料：取50µl，加入950µl樣本復溶液，渦動混勻30s，取50µl 用于檢測。

2、 濃縮料/預混料：取25µl，加入975µl樣本復溶液，渦動混勻30s，取50µl 用于檢測。

樣本稀釋倍數：

配合料稀釋倍數：100       

濃縮料、預混料稀釋倍數：200  

（d） 尿樣樣本處理方法

1、 取2ml尿液到離心管中，室溫4000r/min以上，離心10min，直至清亮；

2、 移取1ml清亮尿液至離心管中，加入1ml　1M NaOH強烈振蕩5min；

3、 加入100µl  6M H₃PO₄，渦動30 s；

4、 再加入8ml氯仿進行萃取，振蕩5min。15℃，4000r/min以上離心10min；

5、 去掉上層的水相，取下層有機相4 ml，60℃氮氣/空氣吹干；

6、 用3ml樣本復溶液干燥的殘留物，混合30s

7、 取50µl用于分析。

樣本稀釋倍數：6

六、 酶標免疫分析程序:

u 測定前應須知：

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。

2、 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。

3、 在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

u 操作步驟：

1、 從2～8℃冷藏環境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

4、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

5、 加標準品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加加入抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。37℃環境中反應30min。

6、 將孔內液體甩干，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、 每孔加入酶標記物100µl，蓋板膜蓋板后置37℃環境中反應30min。將孔內液體甩干，用洗滌液充分洗，4～5遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

8、 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，37℃環境中避光顯色15min。

9、 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內讀數），測定每孔OD值。

七、結果判定

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含己烯雌酚量成負相關。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標準液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.1ppb為1.816；0.3ppb為1.415；0.9ppb為0.74；2.7ppb為0.313；8.1ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb～8.1ppb；樣本2的濃度范圍是0.3ppb～0.9ppb，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中己烯雌酚實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以己烯雌酚標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中己烯雌酚實際濃度。

若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）

八、 注意事項

1、 室溫低于25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。

4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質。

8、 該試劑盒最佳反應溫度為37℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。

九、儲藏條件和保質期

1、 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。

2、 保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。

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