恩諾沙星

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

    試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物恩諾沙星藥物和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗恩諾沙星藥物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留恩諾沙星藥物的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物恩諾沙星藥物的含量。

二、試劑盒特性

u 試劑盒靈敏度：      1ppb

u 孵育溫度：          25℃

u 孵育時間：          30min～15min

u 樣本檢測下限

恩諾沙星檢測下限      ····················  1ppb

u 交叉反應(yīng)率

恩諾沙星        ··························    100%

u 樣本回收率

組織 /雞蛋 ···································  80±15%

血   清  ······································  80±15%

蜂   蜜  ······································  75±15%

三、試劑盒組成

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：微孔酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：單道 20～200ul、單道100～1000ul、多道 250 ul

試      劑：濃鹽酸、二氯甲烷、正己烷、乙腈、肝素鈉、Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O

五、樣本前處理步驟

u 樣本處理前須知

處理任何樣本時，都必須注意：

（a） 本試劑盒所檢測的組織樣本包括：動物組織、禽類和水產(chǎn)組織。eg:雞、鴨、牛、兔、魚、蝦等。

（b） 實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（c） 實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

u 樣本前處理需配制：

配液1  0.1M HCL溶液：  

        860µl濃鹽酸加去離子水100ml溶解。

配液2  乙腈-二氯甲烷混合溶液：

         V_乙腈：V_二氯甲烷  =  1 : 4

配液3  pH7.2  0.02M PB緩沖液：      

   5.16g Na₂HPO₄·12H₂O + 0.87g NaH₂PO₄·2H₂O  

    加去離子水1L溶解。

配液4  乙腈-二氯甲烷-0.1MHCl混合溶液

100ml乙腈-二氯甲烷(V_乙腈：V_二氯甲烷  = 4 :1） 混合溶液中加入5ml 0.1M HCl溶液。

配液5  用去離子水將2X濃縮復(fù)溶液按1：1稀釋  

（1份濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于樣本復(fù)溶。

（a）組織樣本（雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚等）雞蛋

1、稱2.0±0.05g 均質(zhì)過的組織樣本于50ml離心管中；

2、加入乙腈-二氯甲烷混合溶液8ml，振蕩5min，4000r/min以上，15℃離心10min；

3、取4ml有機相至干燥容器中，56℃氮氣吹干/旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干；

4、用1ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1ml混合30s，4000r/min以上，15℃離心5min；

5、去除上層取下層50µl液體用于分析。

     樣本稀釋倍數(shù)：1

（b）血清樣本的處理

1、用加有肝素鈉（20-30單位/ml血）的離心管采集雞血樣本（建議采血注射器也用肝素鈉潤洗），血樣本室溫靜置1h，待析出血漿后4000r/min以上，15℃離心10min，取出血漿1ml；

2、加入乙腈（無水）4ml上下充分混合5min，4000r/min以上，15℃離心10min；

3、移上清至另一離心管中，加入2ml 0.02M PB緩沖液，混勻；

4、加入二氯甲烷5ml，充分混勻5min，4000r/min，15℃離心10min，去上層，取下層有機相到干燥瓶中（清亮無雜質(zhì)），50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干/氮氣吹干；

5、用1ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1ml混合30s，4000r/min以上，15℃離心5min；

6、輕吸掉上層和中間白色雜質(zhì)，取下層相100µl加入100µl稀釋后的復(fù)溶液，混合30s；

7、取50µl用于分析。

       樣本稀釋倍數(shù)：2

（c）蜂蜜樣本處理方法：

1、 取2.0±0.05g蜂蜜樣本于50ml離心管中；加入8ml乙腈-二氯甲烷-0.1MHCl混合溶液， 充分振蕩3min，15℃ 4000r/min以上離心10min；

2、 取2ml上清液于56℃氮氣或空氣流吹干；

3、 加入1ml的樣本復(fù)溶液，充分震蕩1min；

4、 取50µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  2倍

六、 酶標(biāo)免疫分析程序:

u 測定前應(yīng)須知：

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。

2、 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。

3、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

u 操作步驟：

5、 將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

6、 按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存于2-8℃，不要冷凍。

7、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

8、 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均需做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔的樣本孔所在的位置。

9、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl /孔，然后加酶標(biāo)記物50μl/孔，再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境反應(yīng)30min。

10、 用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

11、 顯色：每孔加入底物A液50µl再加入底物B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色15min。

12、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定吸光度值（OD值）。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含恩諾沙星藥物量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定：

    用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.238， 樣本2的吸光度值為0.946，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.845； 1ppb為1.542；3ppb為1.130； 9ppb為0.635；27ppb為0.326； 81ppb為0.156。則樣本1的濃度范圍是27ppb - 81ppb；樣本2的濃度范圍是3ppb - 9ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中恩諾沙星藥物的實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中恩諾沙星藥物實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索取）

八、 注意事項

1、 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質(zhì)期

1、 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。

2、 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。

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