可樂定檢測試劑盒使用說明書
【原理】
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物可樂定與微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗磺胺的抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含可樂定的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出殘留物可樂定的含量。
【試劑盒技術指標】
規(guī) 格：96孔/盒
靈 敏 度：0.2ppb
檢測時間： 45min
樣本檢測下限：
尿 樣 ………………………………… 0.2ppb
組 織 ………………………………… 0.4ppb
飼 料 …… …………………………… 8ppb
交叉反應率：
可樂定………………… 100%
樣本回收率：
尿 樣 ……………………… 95%±10%
組 織 ……………………… 85%±15%
飼 料 ……………………… 85%±15%
【試劑盒組成】
2、 微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）
3、 （標準溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.2ppb、0.6ppb、1.8ppb、5.4ppb、16.2ppb
4、 可樂定高濃度標準溶液（1ml/瓶）100 ppb
5、 酶標記物 7ml…………………………紅色帽
6、 抗體工作液 7ml……………………… 綠色帽
7、 底物A液 7ml ……………………棕色帽
8、 底物B液 7ml ……………………黑色帽
9、 終 止 液 7ml ……………………黃色帽
10、 2X濃縮復溶液50 ml ………………藍色帽
11、 2X濃縮洗滌液40 ml ………………白色帽
【 所用儀器、試劑】
具備的儀器：微孔酶標儀、氮氣吹干裝置、打印機、均質器 、振蕩器、離心機、恒溫箱、天平（感量0.01g）、刻度移液管
微量移液器：單道20µl-200µl、100µl-1000µl、多道 250µl
試 劑： 濃HCl、甲醇、
【實驗前溶液配制】
配液1、將2X濃縮復溶液用去離子水按照1：1稀釋（1 份濃縮復溶液+1份去離子水）用于樣本的復溶。
配液2、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照 1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
配液3、 0.1M HCl 溶液
取0.86ml濃HCl加水定溶至100ml。
配液4、樣品提取液溶液
取1ml 0.1M鹽酸加到99ml甲醇中。
【樣本前處理步驟】
樣本處理前須知
處理任何樣本時，都必須注意：
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
（c）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。
（a）尿樣本的處理方法（樣本稀釋倍數(shù)：1）
取50µl清亮尿樣直接測定（如果尿樣渾濁一定要過濾或離心10min，4000r/min，直至得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應冷凍保存。
由于尿液陰性樣本可能會產(chǎn)生背景干擾 （在某些情況下干擾數(shù)值在標準2到3之間），所以推薦標準3即0.3ppb作為尿液陽性結果的CUT OFF判斷值。
（b）組織樣本的處理方法（樣本稀釋倍數(shù)：2）
1． 稱取2 ±0.05g的組織，加入4ml樣品提取液，振蕩2min,室溫4000r/min以上離心10min。
2． 取上清2ml，于50℃氮氣或空氣吹干。
3． 加1 ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加1ml稀釋后的復溶液強烈振蕩混合30s，室溫4000r/min以上離心5min。
4． 取50µl進行分析。
（C）飼料樣品的處理方法（樣本稀釋倍數(shù)：40）
1. 稱1.0±0.05g研碎的飼料樣品，加入4ml樣品提取液，放振蕩器上振蕩2min；室溫 4000r/min以上離心10min；
2. 取出上清液50ul與450ul稀釋好的復溶液混合30s。
取50ul上清進行分析。
【酶標免疫分析程序】
操作步驟：
1、 將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 按板架及需要取出微孔條，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
4、 加標準品/樣本50µl /孔，然后加酶標記物50μl/孔，再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境反應30min。
5、 取出用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）
6、 顯色：每孔加入底物液A液50µl再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色15min。
7、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定吸光度值（OD值）。
【結果判定】
結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與可樂定的含量成負相關。
1、 粗略判定
用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng /ml)。假設樣本1的吸光度值為0.221，樣本2的吸光度值為0.795，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.81；0.2ppb為1.50；0.6ppb為1.114；1.8ppb為0.660； 5.4ppb為0.318；16.2ppb為0.145。則樣本1的濃度范圍是5.4ppb-16.2ppb；樣本2的濃度范圍是0.6ppb-1.8ppb。乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中可樂定實際含量。
2、 定量分析
（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即：
百分吸光度值（%） ＝ | B | ×100% |
B0 |
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值
（2）標準曲線的繪制與計算
以標準品百分吸光率為縱坐標，以可樂定濃度（ng /ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中可樂定實際含量。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）
3、標準曲線：
B/B0 (%)
0.2 0.6 1.8 5.4 16.2
(ppb) [µg/kg]
圖1：可樂定檢測試劑盒的回歸曲線
4、再現(xiàn)性：
%CV
0 0.2 0.6 1.8 5.4 16.2
(ppb) [µg/kg]
圖2：可樂定檢測試劑盒的精密度
由多個不同的實驗結果確定了精密度，圖2顯示出可樂定檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應可樂定濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。
【注意事項】
1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。
4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。
8、 該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
【儲存】
原包裝應儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。
【有效期】
有效期12個月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號見外包裝。
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