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      小鼠支原體(Mycoplasmal)酶聯免疫分析(ELISA)
      點擊次數:1881 更新時間:2012-07-05

      小鼠支原體(Mycoplasmal酶聯免疫分析(ELISA

      試劑盒使用說明書

      本試劑僅供研究使用       目的:本試劑盒用于檢測小鼠血清,血漿及相關液體樣本中支原體(Mycoplasmal)水平。

      實驗原理

        本試劑盒用雙抗夾心酶聯免疫ELISA測定標本小鼠支原體(Mycoplasmal。用純化的小鼠支原體(Mycoplasmal抗體包被微孔板,制成固相抗可與樣品中支原體(Mycoplasmal相結合經洗滌除去未結合的抗體和其他成分后再與HRP標記的支原體(Mycoplasmal抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經過*洗滌后底物TMB顯色。TMBHRP酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),與CUTOFF值相比較,從而判定標本中小鼠支原體(Mycoplasmal的存在與否。

      試劑盒組成

      試劑盒組成

      48孔配置

      96孔配置

      保存

      說明書

      1

      1

      封板膜

      2片(48

      2片(96

      密封袋

      1

      1

      酶標包被板

      1×48

      1×96

      2-8℃保存

      陰性對照

      0.5ml×1

      0.5ml×1

      2-8℃保存

      陽性對照

      0.5ml×1

      0.5ml×1

      2-8℃保存

      酶標試劑

      3 ml×1

      6 ml×1

      2-8℃保存

      樣品稀釋液

      3 ml×1

      6 ml×1

      2-8℃保存

      顯色劑A

      3 ml×1

      6 ml×1

      2-8℃保存

      顯色劑B

      3 ml×1

      6 ml×1

      2-8℃保存

      終止液

      3ml×1

      6ml×1

      2-8℃保存

      濃縮洗滌液

      20ml×20倍)×1

      20ml×30倍)×1

      2-8℃保存

      樣本處理及要求

      1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清,保存過程中如出現沉淀,應再次離心。

      2. 血漿:應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應該再次離心。

      3. 尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

      4. 細胞培養上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時,用PBSPH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100/ml左右。通過反復凍融,以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應再次離心。

      5. 組織標本:切割標本后,稱取重量。加入一定量的PBSPH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBSPH7.4),用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。

      6. 標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但避免反復凍融.

      7. 不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

      操作步驟

      1. 編號:將樣品對應微孔按序編號,每板應設陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照1孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)

      2. 加樣:分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50μl。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,

      3. 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   

      4. 配液:將3048T20倍)倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用

      5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干。

      6. 加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。 

      7. 溫育:操作同3

      8. 洗滌:操作同5

      9. 顯色:每孔先加入顯色劑A 50μl,再加入顯色劑B 50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘

      10. 終止:每孔加終止50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)

      11. 測定:以空白空調零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值) 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

      結果判定:

        試驗有效性:陽性對照孔平均值1.00; 陰性對照平均值0.10

        臨界值(CUT OFF)計算:臨界值=陰性對照孔平均值+0.15

        陰性判定:樣品OD< 臨界值(CUT OFF)者為小鼠支原體(Mycoplasmal陰性

        陽性判定:樣品OD 臨界值(CUT OFF)者為小鼠支原體(Mycoplasmal陽性

      注意事項

      1.操作嚴格按照說明書進行,本試劑不同批號組分不得混用。

      2.試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未用完,板條應裝入密封袋中保存。

      3濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結果。

      4. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

      5.底物請避光保存。

      6.試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準,使用雙波長檢測時,參考波長為630nm

      7.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。終止液為2M的硫酸,使用時必須注意安全。

      保存條件及有效期

      1試劑盒保存:2-8

      2.有效期:6個月

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